Como o TMAO nos enganou

Em 2011, um grupo de pesquisadores publicou um artigo na Nature, 1 relacionando o composto N-óxido de trimetilamina (TMAO) à doença cardiovascular (DCV). Desde então, o papel do TMAO na patologia da DCV tem acumulado mais e mais evidências, convencendo vários céticos ao longo do caminho de sua importância.

Para aqueles que não são familiares, o TMAO é um metabólito produzido por micróbios intestinais de substratos da dieta, como a colina, a betaína e a carnitina, todos encontrados em produtos de origem animal. Estes substratos dietéticos são convertidos por certos micróbios no gás trimetilamina (TMA), que é então oxigenado por certas enzimas hepáticas para formar TMAO (estrutura química mostrada acima).

Sabemos que os micróbios são necessários para este processo porque os experimentos mostraram que os antibióticos orais suprimem a produção de TMAO, mesmo na presença desses substratos dietéticos. Uma vez formado, o TMAO é então transportado para os tecidos do corpo, onde se acumula, enquanto parte dele é eliminada pelos rins.

Mecanismos do TMAO

Existem vários mecanismos pelos quais se acredita que o TMAO causa doença cardiovascular, mas o principal deles envolve níveis mais altos de aumento dos receptores de eliminação em macrófagos. Mais receptores de sequestradores aumentam a probabilidade desses macrófagos se ligarem à lipoproteína de baixa densidade (LDL) e formarem células espumosas, nomeadas por sua… aparência espumosa.

A criação de células espumosas e a sua localização em depósitos de gordura nos vasos sanguíneos podem interromper o influxo de colesterol, a esterificação, o efluxo e promover a inflamação, aumentando o risco de DCV. Esse processo pode ser visto na imagem abaixo, tirada de Tang et al.
TMAO e Doença Cardiovascular

Vários estudos observacionais encontraram associações entre os níveis de TMAO e o risco de DCV, mas, mais importante, três recentes revisões sistemáticas e metanálises de estudos de coorte também encontraram aumento na mortalidade por todas as causas e eventos cardiovasculares.


Se assumirmos, apenas por causa desta discussão, que os mecanismos biológicos são válidos e que os resultados dos estudos de coorte não estão seriamente afetados por erros estocásticos e vieses (o que é irônico, dado o quanto eu discuti erro de medição e multiplicidade em epidemiologia nutricional), então podemos visualizar nosso conhecimento com o seguinte diagrama causal.


Para recapitular, certos substratos alimentares, encontrados principalmente em produtos de origem animal, são convertidos em TMA por micróbios intestinais e depois em TMAO por enzimas hepáticas, que então contribuem para a produção de células espumosas, que quando excessivamente localizadas causam todo tipo de destruição.

Essa evidência convenceu muitos clínicos e pesquisadores a desencorajar o consumo de produtos de origem animal, especialmente a carne vermelha, uma fonte de carnitina. Alguns cardiologistas até recomendaram que os pacientes obtivessem seus níveis de TMAO no sangue medidos para prever seu risco de DCV, o que significa que esses profissionais de saúde o veem como um biomarcador com validade e utilidade clínica.

Nas palavras de Kraus (2018), a validade clínica de um biomarcador é:
"Quão bem o teste mede uma característica clínica de uma doença, desfecho da doença ou resultado do tratamento - é necessário demonstrar a relevância do teste para a condição clínica como um guia para a tomada de decisão clínica."
Kraus (2018) descreve utilidade clínica como,
"Quão bem o teste melhora os resultados do paciente, confirma ou altera um diagnóstico, determina a terapia apropriada ou identifica indivíduos em risco de doença - é necessário para determinar o quão bem um teste equilibra benefícios e danos quando usado no gerenciamento do paciente. Um processo separado da qualificação de biomarcador rege a aprovação de um biomarcador como um exame médico."
Todas essas características são mais prováveis ​​de serem satisfeitas se o biomarcador estiver no caminho causal da doença.
Então, se assumirmos que o TMAO está no caminho causal das DCV, que ele pode prever com precisão o risco de DCV, e que a redução dos níveis de TMAO via certas intervenções também reduz o risco de doença cardiovascular, então achamos o ouro. Infelizmente, a literatura sobre o TMAO como biomarcador é preliminar e mista.

No entanto, isso não impediu os pesquisadores de desenvolver estratégias para reduzir a formação de TMAO. Por exemplo, dê uma olhada em algumas intervenções propostas na tabela abaixo por Velasquez et al. Embora muitos deles possam parecer intervenções de baixo custo com efeitos colaterais mínimos, alguns claramente não são (como tomar antibióticos) e isso tudo supõe que o TMAO seja um marcador válido na via causal. Ele é?

IntervençãoEfeito
AntibióticosDiminuição dos níveis plasmáticos de TMAO
Terapia MicrobiomáticaDiminuição da formação de TMA no intestino
Consumo reduzido de L-carnitina e colinaDiminuir o nível de TMAO
ResveratrolDiminuição dos níveis plasmáticos de TMA e TMAO
MeldoniumProdução reduzida de TMA pelas bactérias da microbiota intestinal
3,3-dimetil-1-butanolInibição da formação de TMA através da inibição de liases da TMA microbiana
Inibição da enzima FMO3Impediu a oxidação de TMA para TMAO

Inconsistências com o TMAO


Várias características do TMAO conflitam com descobertas conhecidas. Por exemplo, peixes e outros frutos do mar contêm algumas das maiores quantidades de TMAO livre, ainda que vários estudos prospectivos tenham encontrado esses alimentos associados a resultados positivos para a DCV.

Uma possível explicação pode ser que esses estudos observacionais são simplesmente não confiáveis ​​e sofrem de muito erro de medição (W_ {ij} = X_ {i} + \ epsilon_ {ij}oi j=XEu+ei j) e flexibilidade analítica. No entanto, até mesmo ensaios controlados randomizados demonstraram que peixes brancos e magros reduzem os lipídios, que são fatores de risco para doenças cardiovasculares.
Alguns argumentam que os ácidos graxos ômega-3 e outros compostos no peixe compensam os efeitos nocivos do TMAO, no entanto, muito disso é especulativo. Aqueles que permanecem céticos em relação à TMAO acreditam que é um fator de confusão e que é a presença de certos micróbios que contribuem para a patologia das DCV, e esses micróbios também produzem TMAO. Podemos ver essa perspectiva visualizada com o diagrama causal abaixo.


É difícil conhecer verdadeiramente o papel do TMAO na patologia da DCV sem um estudo randomizado explicitamente manipulando os níveis de TMAO e olhando para os desfechos clínicos. Felizmente, um estudo publicado recentemente com um design poderoso nos oferece a próxima melhor coisa.

Randomização Mendeliana

Em estudos observacionais em que a exposição é geralmente não aleatória, a capacidade de inferir causa e efeito tende a ser limitada por confundidores ocultos, causalidade reversa, erro de medição e viés de seleção, mesmo com o uso de métodos complexos que tentam fazer grupos tão comparáveis ​​quanto possível. No entanto, um desenho de estudo relativamente novo, chamado randomização mendeliana, oferece uma maneira de abordar muitos desses problemas.

Ele usa uma técnica desenvolvida em econometria chamada análise de variável instrumental, onde certos instrumentos, como genes associados à exposição, são usados ​​como proxies para exposições como TMAO, colina, betaína e carnitina.

Em estudos observacionais, não podemos aleatoriamente amostrar ou atribuir TMAO e seus precursores (praticamente) e olhar para parâmetros clínicos, mas podemos confiar na primeira e segunda leis da herança de Mendel, porque durante a meiose celular, os alelos são aleatoriamente segregados e variados, tornando É improvável que muitos genótipos herdados estejam associados a confundidores de nível populacional.


Em um estudo mendeliano de randomização, uma vez que os instrumentos (certos genes) são conhecidos por serem válidos, eles são testados para associações com os resultados de interesse, tais como eventos de doença cardiovascular. Esse método é poderoso, pois o sortimento aleatório lida com muitos dos problemas que os métodos estatísticos não conseguem.

Essa é a abordagem que um grupo de pesquisadores recentemente usou para testar as associações entre TMAO, colina, betaína e carnitina e desfechos como eventos cardiovasculares, risco de diabetes tipo 2 e doença renal crônica. Os pesquisadores pesquisaram bancos de dados publicados de estudos de associação genômica ampla para procurar variantes genéticas que estavam ligadas às exposições (TMAO, colina, betaína, carnitina), a fim de produzir o seu instrumento.

Eles selecionaram polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) que atingiram o nível de significância da associação genômica ampla (p <0,000005), uma vez que estes têm maior probabilidade de serem replicáveis.

Estes instrumentos foram então testados para associações com os desfechos clínicos. Parece fácil o suficiente... ou não. Não há nada de graça, mesmo em estudos de randomização mendeliana. Para que o instrumento seja válido, ele deve atender certos pressupostos:
  1. A associação entre o instrumento (os genes) e os resultados deve ser apenas através da exposição a que os genes estão ligados. Isso significa que se os genes / SNPs (como aqueles que produzem TMAO) afetam o resultado (CVD) de outras maneiras, o instrumento é inválido.
  2. Os genes devem estar verdadeiramente associados à exposição de interesse. Isso significa que os genes usados ​​no instrumento devem realmente explicar uma parte da variação nas exposições (como colina, betaína, carnitina e TMAO).
  3. Os genes não podem ser associados a confundidores não medidos que estão associados à exposição e ao resultado.
Estas suposições podem ser vistas abaixo, uma imagem tirada do artigo original.
Os pesquisadores garantiram que suas variantes genéticas atendem a essas premissas observando a força das associações entre as variantes genéticas e os metabólitos e selecionaram SNPs independentes com as associações mais fortes (menor valor de P) para cada variante. A desvantagem dessa abordagem é que ela também pode enfraquecer os instrumentos, uma vez que há limites para SNPs com estatísticas de teste mais baixas que ainda podem explicar uma quantidade notável de variação. Os autores explicam quanta variação do metabolito é explicada por seus SNPs selecionados,
"Nossa análise genética mostrou que 15,4% de betaína, 17,1% de carnitina, 8,0% de colina e 9,6% de TMAO foram explicados pelos seus SNPs."
Os autores definiram seu nível alfa em P ≤ 0,0005 (0,05 / 100) após a correção de Bonferroni para comparações múltiplas e obtiveram resultados ≤ 0,05 como sugestivos de uma associação. Eles conduziram uma análise de potência apriori com um nível alfa de 0,05, para detectar pelo menos um aumento de 30% nas chances de eventos cardiometabólicos para os substratos e metabólitos da dieta.
"O cálculo da potência de MR ( http://cnsgenomics.com/shiny/mRnd ) mostrou que temos 87%, 84%, 78%, 81% de poder para testar o efeito causal significativo (P <0,05) (OR = 1,3) da betaína, carnitina, colina e TMAO em eventos cardiometabólicos, respectivamente."
Como já discuti em posts anteriores, o poder estatístico e a significância estatística têm menos peso na maioria dos estudos observacionais porque não há mecanismo aleatório.
"A randomização fornece o elo fundamental entre a estatística inferencial e os parâmetros causais. Estatísticas inferenciais, como valores de P, intervalos de confiança e razões de verossimilhança, têm um significado muito limitado na análise causal quando o mecanismo de atribuição de exposição é amplamente desconhecido ou é conhecido por ser não aleatório. É minha impressão que tais estatísticas recebem muitas vezes um peso de autoridade apropriado somente em estudos randomizados."
No entanto, como há um processo aleatório aqui (sortimento aleatório de alelos durante a meiose), os autores justificam-se em testar hipóteses estatísticas e enfocar o poder e a significância. Naturalmente, isso não é um incentivo para tomar decisões dicotômicas sem pensar em todos os dados.

Resultados
Para TMAO geneticamente previsto, nenhuma das associações com desfechos cardiometabólicos foi estatisticamente significativa. Embora para doença renal crônica e infarto do miocárdio, houve pequenos aumentos nas chances (8%) e as estimativas de intervalo foram bastante amplas, com aumentos de até 60% e 99% para infarto do miocárdio e doença renal crônica, respectivamente, sendo compatível com os dados.

Para a colina geneticamente predita, houve um aumento de 84% nas chances de diabetes tipo 2 de 1,84, (95% CI: 1,00, 3,42) (P = 0,05) e para betaína houve uma diminuição de 32% nas chances de tipo 2 diabetes 0,68 (IC 95%: 0,48, 0,95) (P = 0,023).

Como este estudo foi um estudo bidirecional de randomização mendeliana, os autores foram capazes de usar instrumentos para as exposições e os resultados para avaliar os efeitos causais em ambas as direções. Uma figura do que isso geralmente é mostrado abaixo, tirada de Haycock et al.

Eles resumem suas descobertas,
"Nós examinamos ainda os efeitos causais das doenças cardiometabólicas nos metabólitos dependentes do intestino. Nós descobrimos que o DM2 estava causalmente associado com betaína baixa (beta: -0.111, SE: 0.035, P = 0.002) e níveis mais altos de TMAO (0.13 ± 0.036, P <0.0001) para cada unidade com odds maiores. A DRC também foi associada causalmente com níveis mais altos de TMAO (0,483 ± 0,168, P = 0,004) para cada odds maiores de 1 unidade."
Isso faz sentido, já que os níveis de TMAO são mantidos pelo rim e a doença renal crônica levaria a níveis mais altos de TMAO no sangue. Assim, embora estudos prévios frequentemente encontrassem associações, a direção da relação (desenhada abaixo) estava na direção oposta.


Embora este estudo forneça dados convincentes e contraditórios, suas conclusões também são limitadas por algumas escolhas metodológicas. Por exemplo, os autores optaram por usar o nível de significância do genoma (P <0.000005) para escolher os SNPs que estavam associados às exposições, o que levaria a instrumentos mais fracos que poderiam ter influenciado as associações para o nulo.

Burgess & Thompson, 2011 descrevem isso elegantemente em seu artigo Statistics in Medicine,
"Um 'instrumento fraco' é definido como um instrumento para o qual a evidência estatística de associação com o fenótipo (X) não é forte. Um instrumento pode ser fraco se explicar uma pequena quantidade da variação do fenótipo, em que a quantidade definida como 'pequena' depende do tamanho da amostra. A estatística F no primeiro estágio de regressão de X em G é geralmente citada como uma medida da força de um instrumento.
Embora os métodos IV sejam assintoticamente imparciais, eles demonstram viés sistemático de amostra finita. Esse viés, conhecido como "viés fraco do instrumento", está na direção da associação observacional confusa entre o fenótipo e o desfecho, e depende da força do instrumento. Instrumentos fracos também estão associados a intervalos de confiança subestimados e propriedades de cobertura deficientes.
Um critério geralmente citado é que um instrumento é fraco se a estatística F na regressão G – X for menor que 10. No entanto, o uso de instrumentos com F> 10 apenas reduz o viés para menos de um determinado nível, e problemas com viés de instrumento fraco ainda ocorrem."
Eles fornecem recomendações práticas:
"Concluímos com o seguinte conselho aos profissionais:
  • Os instrumentos genéticos usados ​​nos estudos de randomização mendeliana devem ser pré-especificados antes da coleta e análise de dados. As hipóteses IV subjacentes devem ser testadas com cuidado, tanto quanto possível.
  • Os tamanhos de amostra devem ser escolhidos sempre que possível para garantir que o valor esperado de F seja maior que 10. As estatísticas F devem ser citadas ao relatar os resultados do estudo, mas as estatísticas F ou outras medidas de força do instrumento nos dados não devem determinar a análise usada.
  • Onde houver problemas potenciais com instrumentos fracos, os resultados devem ser avaliados quanto ao viés por análises de sensibilidade, usando várias suposições no modelo de associação genética e métodos de análise IV, como o LIML."
Apesar dessas limitações, o estudo mostrou que havia associações muito pequenas entre as exposições de interesse e os desfechos clínicos, que muitas vezes foram grandes em quase todos os estudos de coorte, provavelmente devido a fatores de confusão. Além disso, o estudo descobriu que o diabetes tipo 2 e a doença renal crônica estavam causalmente associados aos níveis de TMAO, resolvendo o problema da causalidade reversa encontrado em estudos de coorte anteriores.

Resultados como esse mostram como é difícil determinar a natureza das relações entre dieta e saúde. Embora existam mecanismos válidos pelos quais a TMAO possa contribuir para doenças cardiometabólicas, existem vários outros mecanismos de confusão que podem explicar as associações entre a exposição e o desfecho. Na ausência de mecanismos aleatórios, é meticulosamente difícil entender a direção dos efeitos em situações tão complexas.

Embora tenha havido apoio de estudos mecanicistas, estudos de coorte e ensaios randomizados que avaliaram os efeitos dos alimentos nos níveis de TMAO, os resultados deste estudo com um mecanismo aleatório sugerem fortemente que a relação causal está na direção oposta. No entanto, este é apenas um estudo e uma pequena peça do quebra-cabeça. Estudos futuros com mecanismos aleatórios (sejam eles estudos de randomização mendeliana ou ensaios randomizados) precisarão replicar esses achados.

Os resultados deste estudo e a história do TMAO me lembram uma citação de Steve Goodman em seu recente artigo no The American Statistician.
"Um ensaio clínico que abalou o núcleo da cardiologia foi o Cardiac Arrhythmia Suppression Trial (CAST), concluído em 1991 (Echt et al. 1991). As terapias testadas no estudo CAST eram conhecidas por interromper as arritmias consideradas responsáveis ​​pela morte súbita cardíaca, que estava matando mais de uma pessoa a cada minuto, ou cerca de 1200 por dia. O CAST revelou que essas drogas, as drogas mais prescritas nos Estados Unidos, estavam quase quadruplicando a taxa de morte súbita, matando mais americanos na década anterior do que na maioria das guerras.
Isso ensinou à comunidade de cardiologia o perigo de usar endpoints alternativos e a falta de confiabilidade do conhecimento mecanicista de forma mais eficaz do que poderia haver mil palestras, artigos ou diagramas causais. No entanto, poucos médicos de outras disciplinas sabem disso e aprenderam essa lição. Essas outras áreas têm suas próprias histórias, mas mesmo as mais dramáticas, como a história "omics" de Duke (Micheel et al. 2012), são pouco conhecidas fora de seus próprios domínios."
Fonte: http://bit.ly/32bnGXJ

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